Plantas a la carta

    El cultivo in vitro de tejidos vegetales incluye una serie de técnicas en las que un trocito de tejido cultivado en asepsia y llamado explanto, mediante condiciones controladas puede llegar a generar una planta clónica igual que la planta madre de la que procede.

    Esta técnica se basa en la capacidad de las células vegetales de regenerar una planta completa mediante la influencia de reguladores de crecimiento (fitohormonas) que se añaden al medio de cultivo (auxinas y citoquininas). Una proporción hormonal adecuada de ambas hace que las células diferenciadas (células con forma y función específica) se desdiferencien y se vuelvan células totipotentes, así se desarrollan las células madres de las plantas.

    En función de los reguladores de crecimiento que se añadan al medio podemos obtener de esas células: tallos, raíces, embriones, callo, etc… Concretamente, el callo es una estructura vegetal tipo tumor, de crecimiento activo, con células en diferente estadío de diferenciación, que pueden regenerar órganos vegetales e incluso embriones para formar semillas artificiales. Es como si de un trocito de piel humana que se pusiera en medio de cultivo adecuado, se desdiferenciasen sus células en un aglomerado de células madres y regenerasen en embriones y, por lo tanto, clones humanos.

    Por otro lado, tenemos a la bacteria fitopatógena Agrobacterium tumefaciens. Su forma de infectar a las plantas resulta muy interesante para la biotecnología, ya que es capaz de insertar en el genoma de las células vegetales una parte de su DNA del plásmido llamado T-DNA (DNA transferente) haciendo que las células fabriquen para la bacteria alimentos y esta pueda vivir de forma parasitaria en ellas.

    Aprovechando la capacidad de regenerar una planta completa a partir de una célula vegetal somática, y las características especiales de Agrobacterium como vehículo de transporte de genes, podemos insertar genes foráneos de interés en el genoma vegetal artificialmente, ya que de forma natural sería impensable. Esta es una metodología que se realiza en el Servicio de cultivo de plantas de los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación. Es muy usada y extendida para la mejora genética vegetal (obtención de plantas transgénicas) pudiendo insertar en plantas genes de la misma especie, otras especies e incluso de animales, bacterias, etc.

    Para ello hay que manipular el plásmido de Agrobacterium, introduciéndole la secuencia del gen que nos interesa estudiar in vivo, además de un gen chivato o de resistencia a alguna sustancia (normalmente antibióticos). Esta mejora extra les posibilitará la selección de las células que han adquirido el T-DNA y se multiplicarán en el medio específico frente a las que no lo tengan, que terminarán muriendo. En otros casos se incluye también la GFP, proteína fluorescente verde de una medusa que hace que los callos sean fluorescentes cuando se ilumina con luz azul permitiendo su selección in situ.

    Cuando está todo preparado, se ponen en contacto los explantos con Agrobacterium. Después de sucesivos cambios de medio de cultivo (subcultivos) y eliminar Agrobacterium de los explantos, comenzarán a regenerar callo y finalmente tallo que tendrán los nuevos genes insertados. Este tallo se pone en un medio de enraizamiento, y ya tenemos una planta igual que la planta madre, pero con las características adquiridas del nuevo gen.

    La confirmación definitiva se realiza mediante PCR, amplificando un fragmento del transgen. Solo queda pasarla al invernadero y ver si funciona. El gen foráneo, si es de la misma planta, puede sobreexpresar esa característica o puede silenciarla. Cuando es de otro organismo se le puede conferir una característica nueva nunca antes conseguida.

Ventajas de la metodología:

• El bajo coste que tiene el material que se emplea (material vidrio reutilizable) y aparatos.
• Se pueden conseguir plantas con características mejoradas en 2 años en el laboratorio si el experimento marcha bien. Pese a lo que pueda parecer, es una gran reducción de tiempo si lo comparamos con los programas de mejora genética clásica que pueden llegar a tardar incluso décadas.
• Este tipo de mejora genética está sometido a controles muy exhaustivos antes de salir al mercado, aunque su principal uso es para investigación.

También tiene sus inconvenientes:

• Los protocolos deben estar puestos a punto, llevando años de experimentos para conseguirlos.
• Es una metodología muy laboriosa. Los medios de cultivo, que se deben preparar en cada momento, son muy variados en función de la planta y el proceso de morfogénesis en el que se encuentre. Es necesario tener el material vegetal en condiciones óptimas llevando a cabo un mantenimiento constante. Cualquier contaminación o subida de temperatura de la cámara tira a la basura años de trabajo.
• Agrobacterium se inserta al azar en el genoma de cada célula, pudiendo afectar, según donde se inserte, a cualquier aspecto morfológico o fisiológico de la planta, llegando a no ser funcional y morir. Esto requiere generar en un experimento de transformación muchísimas líneas diferentes para garantizar su éxito.
• La bacteria solo infecta dicotiledóneas, por lo que también se utiliza otra metodología que dispara -literalmente- la secuencia genética de interés al genoma de la planta mediante una pistola de genes. Es lo que se conoce como biolística, también (mal) llamada biobalística.

    Estos inconvenientes hacen que la obtención de plantas transgénicas sea uno de los cuellos de botella de la mejora genética dirigida. La gran variabilidad que hay en los protocolos, los cambios que hay que realizar en función del proceso de morfogénesis que se encuentre el explanto (a ojo de buen cubero) y la dificultad de reproducirlos en muchas ocasiones en el laboratorio hace que esta metodología dé más de un quebradero de cabeza.

    Hay otros métodos de transformación genética, aunque este es uno de los más usados y efectivos. De esta forma se han obtenido plantas con resistencia a insectos, enfermedades, hongos; otras que crecen el doble de rápido; resistente a herbicidas; fruta que mejora sus características organolépticas (sabor, textura) y prolongan su tiempo de postcosecha, fruto que se emplea como vacuna al ingerirlo, modificación de la forma y color de la flor, etc. Es la forma de obtener y diseñar plantas a la carta.

Lara Silvia Jiménez Bermúdez

Unidad de Cultivo de Plantas

Charcutería científica

La limitación del ojo humano sólo nos deja ver aquello que tenga un tamaño no inferior a una décima de milímetro. Por suerte, los microscopios solventarán esta limitación y nos permitirán ver cosas que no podemos apreciar a simple vista. En esta entrada no voy a describir el funcionamiento de los microscopios, sino que me voy a centrar en explicar cómo deben ser preparadas las muestras para poder ser vistas a un microscopio.

¿POR QUÉ SE DEBEN PROCESAR LAS MUESTRAS?

La mayoría de estructuras celulares y tisulares (células y tejidos) no se pueden apreciar con nuestros ojos debido al “limitado” poder de resolución de los mismos, teniéndose que utilizar microscopios para ello. Los tejidos tampoco presentan contraste suficiente para que se puedan discriminar estas estructuras con facilidad. Por todo ello las muestras han de ser procesadas previamente para evitar su deterioro y poder resaltar las estructuras que queremos estudiar en profundidad. Esto mismo ocurre con las estructuras nanométricas de las muestras materiales.

Se podría decir que existen tantos protocolos de preparación como muestras diferentes. La elección de un protocolo u otro va a depender de:

- Tipo de muestra. Podríamos clasificar las diferentes muestras en función de su naturaleza: materiales o biológicas. Aunque quiero destacar que no todas las muestras biológicas (tejido animal, vegetal, nervioso, microbiológico…) se preparan empleando protocolos idénticos.

- Técnica microscópica empleada. Según la información que queramos obtener de la muestra emplearemos una técnica microscópica u otra. En función de esta técnica, las muestras se prepararán siguiendo un protocolo u otro.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

Para profundizar en el tema, nos vamos a centrar en la preparación de muestras biológicas y obviaremos a las muestras materiales. Vamos a suponer que hemos recibido una muestra de bacterias y que el usuario quiere obtener tanto imágenes de microscopía óptica como de microscopía electrónica (transmisión y barrido) de ella. Para ello, se debe preparar la muestra siguiendo el esquema siguiente:

Esquema de los protocolos de preparación de muestras biológicas para las distintas técnicas microscópicas.

El conjunto de etapas a las que se somete una muestra biológica para poder ser vista a través de un microscopio reciben el nombre de técnicas histológicas. El objetivo de estas técnicas es permitir la observación de las estructuras tisulares tal y como se apreciarían si se observaran los tejidos in vivo.

En el esquema se aprecian dos etapas comunes en todos los protocolos de preparación: fijación y deshidratación. La fijación es la primera etapa y la más importante del proceso histológico, consiste en mantener inalteradas las características morfológicas (forma), estructurales y de composición del tejido de tal manera que sean las más parecidas al tejido vivo. Sería como dar al botón “PAUSE” mientras vemos una película y continuar con esa imagen congelada el resto de las etapas de procesado. La fijación puede ser física (calor o frío) o química (empleándose una solución fijadora), siendo esta última la más empleada. Un ejemplo de fijador es el formol, muy conocido por su utilización en la conservación de cadáveres.

Una vez que la muestra ha sido fijada es necesario deshidratarla debido al elevado porcentaje de agua que contiene este tipo de muestras, la cual interferiría en las etapas sucesivas. La deshidratación se lleva a cabo reemplazando las moléculas de agua por alcohol o acetona.

En este momento es crucial tener claro qué información queremos obtener para así seleccionar la técnica microscópica adecuada y, por tanto, continuar el procesado de la muestra de acuerdo con ello. Como se puede observar en el esquema, existe un paralelismo entre los protocolos de preparación de las muestras utilizadas para microscopía óptica y electrónica de transmisión (TEM). Por ello, vamos a poner nuestro foco de atención en ellos para evitar extendernos demasiado en esta entrada.

Las muestras deshidratadas se incluyen en parafina o en distintos tipos de resinas; la muestra sería como ese grano de pimienta dentro de una loncha de salchichón (resina). Esto se lleva a cabo con objeto de dotar a la muestra de una consistencia suficiente para poder cortarlas en la etapa posterior. Imaginaos lo que sería intentar cortar una porción de cerebro de rata con un espesor de 1 micra (la centésima parte de un cabello humano) sin incluirlo en ese soporte, ¿no os hacéis a la idea? Pues os ayudo recurriendo de nuevo al símil charcutero, sería la diferencia entre cortar un embutido fresco (cerebro sin incluir) y cortar uno curado, mucho más fácil cortar el segundo ¿verdad?

Una vez que os he convencido de la necesidad de incluir la muestra en un soporte rígido, hay que proceder al corte de la misma. Por tanto, trasladamos la muestra a la sección de “charcutería científica”. En esta sección encontraremos distintos equipos de corte, nosotros elegiremos el equipo adecuado según el espesor del corte requerido. Los espesores de corte oscilarán desde unas micras, para óptica, a unos 100 nm, para TEM. Los cortes de 100 nm se obtienen con el ultramicrotomo y reciben el nombre de cortes ultrafinos por su pequeñísimo espesor, similar a la milésima parte de un cabello humano.

Equipos de corte de la “Charcutería científica”. A) Microtomo. B) Vibratomo. C) Criostato. D) Ultramicrotomo.

Ya tenemos nuestros ansiados cortes, pero siento deciros que aún no hemos acabado con la muestra. Tenemos los cortes con la región de interés de la muestra inalterada pero las estructuras no se pueden discernir con claridad si no sometemos a la muestra a un proceso de tinción o contrastado. En el primer caso, se tiñen las estructuras empleándose un colorante que permitirá la observación de las mismas diferenciadas con colores mediante un microscopio óptico. Mientras que la utilización de agentes de contraste (acetato de uranilo o acetato de plomo), nos proporcionará un mayor contraste de las estructuras en las imágenes de TEM.

A continuación, se muestran imágenes de bacterias tomadas empleando distintas técnicas de microscopía. En A) se observan las bacterias teñidas mediante un microscopio óptico. Las imágenes B) y C) son de microscopía electrónica, en la primera se aprecia el tamaño y forma de las bacterias mientras que en la segunda, se puede observar la ultraestructura de las mismas.

A) Imagen de bacterias tomadas por un microscopio óptico. B) Imagen de SEM de bacterias. C) Imagen de TEM de un corte ultrafino de bacerias.

Cristina Lucena Serrano

Unidad de Preparación de Muestras para Microscopía.