Charcutería científica

La limitación del ojo humano sólo nos deja ver aquello que tenga un tamaño no inferior a una décima de milímetro. Por suerte, los microscopios solventarán esta limitación y nos permitirán ver cosas que no podemos apreciar a simple vista. En esta entrada no voy a describir el funcionamiento de los microscopios, sino que me voy a centrar en explicar cómo deben ser preparadas las muestras para poder ser vistas a un microscopio.

¿POR QUÉ SE DEBEN PROCESAR LAS MUESTRAS?

La mayoría de estructuras celulares y tisulares (células y tejidos) no se pueden apreciar con nuestros ojos debido al “limitado” poder de resolución de los mismos, teniéndose que utilizar microscopios para ello. Los tejidos tampoco presentan contraste suficiente para que se puedan discriminar estas estructuras con facilidad. Por todo ello las muestras han de ser procesadas previamente para evitar su deterioro y poder resaltar las estructuras que queremos estudiar en profundidad. Esto mismo ocurre con las estructuras nanométricas de las muestras materiales.

Se podría decir que existen tantos protocolos de preparación como muestras diferentes. La elección de un protocolo u otro va a depender de:

- Tipo de muestra. Podríamos clasificar las diferentes muestras en función de su naturaleza: materiales o biológicas. Aunque quiero destacar que no todas las muestras biológicas (tejido animal, vegetal, nervioso, microbiológico…) se preparan empleando protocolos idénticos.

- Técnica microscópica empleada. Según la información que queramos obtener de la muestra emplearemos una técnica microscópica u otra. En función de esta técnica, las muestras se prepararán siguiendo un protocolo u otro.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

Para profundizar en el tema, nos vamos a centrar en la preparación de muestras biológicas y obviaremos a las muestras materiales. Vamos a suponer que hemos recibido una muestra de bacterias y que el usuario quiere obtener tanto imágenes de microscopía óptica como de microscopía electrónica (transmisión y barrido) de ella. Para ello, se debe preparar la muestra siguiendo el esquema siguiente:

Esquema de los protocolos de preparación de muestras biológicas para las distintas técnicas microscópicas.

El conjunto de etapas a las que se somete una muestra biológica para poder ser vista a través de un microscopio reciben el nombre de técnicas histológicas. El objetivo de estas técnicas es permitir la observación de las estructuras tisulares tal y como se apreciarían si se observaran los tejidos in vivo.

En el esquema se aprecian dos etapas comunes en todos los protocolos de preparación: fijación y deshidratación. La fijación es la primera etapa y la más importante del proceso histológico, consiste en mantener inalteradas las características morfológicas (forma), estructurales y de composición del tejido de tal manera que sean las más parecidas al tejido vivo. Sería como dar al botón “PAUSE” mientras vemos una película y continuar con esa imagen congelada el resto de las etapas de procesado. La fijación puede ser física (calor o frío) o química (empleándose una solución fijadora), siendo esta última la más empleada. Un ejemplo de fijador es el formol, muy conocido por su utilización en la conservación de cadáveres.

Una vez que la muestra ha sido fijada es necesario deshidratarla debido al elevado porcentaje de agua que contiene este tipo de muestras, la cual interferiría en las etapas sucesivas. La deshidratación se lleva a cabo reemplazando las moléculas de agua por alcohol o acetona.

En este momento es crucial tener claro qué información queremos obtener para así seleccionar la técnica microscópica adecuada y, por tanto, continuar el procesado de la muestra de acuerdo con ello. Como se puede observar en el esquema, existe un paralelismo entre los protocolos de preparación de las muestras utilizadas para microscopía óptica y electrónica de transmisión (TEM). Por ello, vamos a poner nuestro foco de atención en ellos para evitar extendernos demasiado en esta entrada.

Las muestras deshidratadas se incluyen en parafina o en distintos tipos de resinas; la muestra sería como ese grano de pimienta dentro de una loncha de salchichón (resina). Esto se lleva a cabo con objeto de dotar a la muestra de una consistencia suficiente para poder cortarlas en la etapa posterior. Imaginaos lo que sería intentar cortar una porción de cerebro de rata con un espesor de 1 micra (la centésima parte de un cabello humano) sin incluirlo en ese soporte, ¿no os hacéis a la idea? Pues os ayudo recurriendo de nuevo al símil charcutero, sería la diferencia entre cortar un embutido fresco (cerebro sin incluir) y cortar uno curado, mucho más fácil cortar el segundo ¿verdad?

Una vez que os he convencido de la necesidad de incluir la muestra en un soporte rígido, hay que proceder al corte de la misma. Por tanto, trasladamos la muestra a la sección de “charcutería científica”. En esta sección encontraremos distintos equipos de corte, nosotros elegiremos el equipo adecuado según el espesor del corte requerido. Los espesores de corte oscilarán desde unas micras, para óptica, a unos 100 nm, para TEM. Los cortes de 100 nm se obtienen con el ultramicrotomo y reciben el nombre de cortes ultrafinos por su pequeñísimo espesor, similar a la milésima parte de un cabello humano.

Equipos de corte de la “Charcutería científica”. A) Microtomo. B) Vibratomo. C) Criostato. D) Ultramicrotomo.

Ya tenemos nuestros ansiados cortes, pero siento deciros que aún no hemos acabado con la muestra. Tenemos los cortes con la región de interés de la muestra inalterada pero las estructuras no se pueden discernir con claridad si no sometemos a la muestra a un proceso de tinción o contrastado. En el primer caso, se tiñen las estructuras empleándose un colorante que permitirá la observación de las mismas diferenciadas con colores mediante un microscopio óptico. Mientras que la utilización de agentes de contraste (acetato de uranilo o acetato de plomo), nos proporcionará un mayor contraste de las estructuras en las imágenes de TEM.

A continuación, se muestran imágenes de bacterias tomadas empleando distintas técnicas de microscopía. En A) se observan las bacterias teñidas mediante un microscopio óptico. Las imágenes B) y C) son de microscopía electrónica, en la primera se aprecia el tamaño y forma de las bacterias mientras que en la segunda, se puede observar la ultraestructura de las mismas.

A) Imagen de bacterias tomadas por un microscopio óptico. B) Imagen de SEM de bacterias. C) Imagen de TEM de un corte ultrafino de bacerias.

Cristina Lucena Serrano

Unidad de Preparación de Muestras para Microscopía.

Abre los ojos

Los humanos somos entes imperfectos, es verdad que hemos conseguido reproducirnos con éxito y conquistar el planeta, pero eso solo nos convierte en los más capaces de nuestro barrio: la Tierra. Si analizamos desde una perspectiva más amplia, más universal, lo cierto es que como humanos adolecemos de muchas cualidades, y aquí vamos a tratar de una de nuestras grandes limitaciones: la vista.

 La capacidad de distinguir con nitidez dos puntos muy cercanos en el espacio es lo que se denomina capacidad o poder de resolución. El ojo humano, sin ayuda, es capaz de resolver o distinguir dos puntos separados no menos de una décima de milímetro (el grosor de un cabello). Para traspasar esta barrera utilizamos lupas y microscopios ópticos que, mediante la adecuada combinación de lentes, desvían los rayos de luz de forma que los contornos de los objetos lleguen aumentados a nuestros ojos. Con ellos podemos observar detalles mucho más pequeños de lo que la vista nos permite, pero también tienen sus límites físicos.

La luz que se refleja en los objetos llega a los fotorreceptores de nuestras retinas, generando una serie de impulsos nerviosos que el cerebro interpreta como formas. Ese chivato (la luz) que nos ayuda a distinguir formas y colores, no es más que una pequeña parte del espectro electromagnético: la región comprendida entre los 700 y los 400 nanómetros. Y son estas longitudes de onda las que limitan la capacidad de aumento de un microscopio óptico, o mejor dicho, su resolución. No podemos resolver detalles menores a la dimensión del patrón que utilizamos para medir.

Rango de longitudes de onda de la luz dentro del espectro electromagnético

Un nanómetro es la milmillonésima parte de un metro, y los microscopios ópticos (con sus 400 nm de resolución) son suficientes para observar multitud de cosas minúsculas, pero muchas otras quedan fuera de su alcance. Un virus, por ejemplo, tiene un tamaño que oscila entre los 350 y los 20 nm. Se necesita otro tipo de instrumento para verlos, y aquí es donde llegamos al microscopio electrónico de transmisión (al que nos referiremos como TEM, por sus siglas en ingles).

Distintos tipos de virus con sus dimensiones comparadas

Un TEM es como un microscopio óptico, solo que en vez de luz utilizamos un haz de electrones acelerado por una gran diferencia de potencial eléctrico, normalmente entre 80 y 300 kilovoltios. El secreto de la resolución alcanzada por estos equipos reside por tanto en que ese haz de electrones se comporta como una onda, como la luz. Se trata del efecto onda-corpúsculo postulado en mecánica cuántica, según el cual los electrones se comportan no solo como partículas, sino también como una onda. La gran ventaja de los electrones frente a la luz es que sus longitudes de onda son del orden de 100.000 veces más pequeñas, lo que nos permite tal poder de resolución que podemos incluso resolver individualmente los átomos que constituyen la materia.

Átomos de una lámina de oro (izquierda) y monocapas atómicas de un nanotubo de carbono (derecha)

Es tal la capacidad de un TEM para adentrarse en lo más profundo de la materia, que el tamaño de la muestra a observar debe ser muy pequeño, minúsculo. No puede ser mayor que el soporte utilizado, un pequeño disco de 3 mm de diámetro. Otro requisito adicional es que la muestra debe ser muy fina para poder ser atravesada por el haz de electrones, de un espesor inferior a los 100 nm (la milésima parte del grosor de un cabello). De hecho, la preparación de muestras para TEM es una disciplina compleja que requiere personal cualificado para poder obtener la máxima capacidad del microscopio.

Soporte de muestras para TEM

El poder de resolución es importante, pero si de los mismos electrones aprovechamos también su naturaleza corpuscular, se pueden extraer toda una serie de señales secundarias debido a la interacción de estos con las partículas de la muestra. Cada una de las señales extraídas de dicha interacción proporciona información adicional sobre la naturaleza de la muestra, y esa información puede ser mapeada o localizada sobre la imagen de la misma. De esta forma podemos observar su estructura física y química a escala nanométrica.

Imágenes de TEM con superposición de información suministrada por la emisión de rayos-X

En el SCAI disponemos de dos TEM, un equipo convencional optimizado para observación de muestras biológicas y otro de alta resolución preparado para observar y caracterizar materiales sintéticos y nanoestructurados (metamateriales).

Microscopios TEM Jeol JEM-1400 (izquierda) y FEI Talos F200X (derecha)

En nuestras instalaciones se llevan a cabo investigaciones de campos muy diversos, como estudios sobre enfermedades neurodegenerativas, optimización de cultivos, producción de biomateriales y biocombustibles, catalizadores para producción de energía y productos químicos, biomarcadores médicos, paneles solares, etc. A continuación mostramos unos ejemplos de las imágenes obtenidas en estos equipos.

Capilar sanguíneo, eritrocitos, mitocondrias, axones (imagen coloreada)

Nanopartículas core-shell de oro recubiertas de plata (mapa EDX superpuesto)

Ordenamiento atómico y defectos cristalinos en lámina de ZnO

Tomografía TEM 3D de material catalítico con nanopartículas de Fe

Todas estas maravillas se encuentran ocultas a la limitada visión humana, pero afortunadamente nuestra capacidad de imaginación no tiene límites y hemos conseguido superar las barreras que nos impedían su observación. La ciencia y la tecnología son ese rompehielos que nos abre el camino hacia terrenos anteriormente vedados a nuestro conocimiento. Así que abre los ojos, hay muchos mundos que descubrir todavía.

Adolfo Martínez Orellana (Unidad de TEM)