Charcutería científica

La limitación del ojo humano sólo nos deja ver aquello que tenga un tamaño no inferior a una décima de milímetro. Por suerte, los microscopios solventarán esta limitación y nos permitirán ver cosas que no podemos apreciar a simple vista. En esta entrada no voy a describir el funcionamiento de los microscopios, sino que me voy a centrar en explicar cómo deben ser preparadas las muestras para poder ser vistas a un microscopio.

¿POR QUÉ SE DEBEN PROCESAR LAS MUESTRAS?

La mayoría de estructuras celulares y tisulares (células y tejidos) no se pueden apreciar con nuestros ojos debido al “limitado” poder de resolución de los mismos, teniéndose que utilizar microscopios para ello. Los tejidos tampoco presentan contraste suficiente para que se puedan discriminar estas estructuras con facilidad. Por todo ello las muestras han de ser procesadas previamente para evitar su deterioro y poder resaltar las estructuras que queremos estudiar en profundidad. Esto mismo ocurre con las estructuras nanométricas de las muestras materiales.

Se podría decir que existen tantos protocolos de preparación como muestras diferentes. La elección de un protocolo u otro va a depender de:

- Tipo de muestra. Podríamos clasificar las diferentes muestras en función de su naturaleza: materiales o biológicas. Aunque quiero destacar que no todas las muestras biológicas (tejido animal, vegetal, nervioso, microbiológico…) se preparan empleando protocolos idénticos.

- Técnica microscópica empleada. Según la información que queramos obtener de la muestra emplearemos una técnica microscópica u otra. En función de esta técnica, las muestras se prepararán siguiendo un protocolo u otro.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

Para profundizar en el tema, nos vamos a centrar en la preparación de muestras biológicas y obviaremos a las muestras materiales. Vamos a suponer que hemos recibido una muestra de bacterias y que el usuario quiere obtener tanto imágenes de microscopía óptica como de microscopía electrónica (transmisión y barrido) de ella. Para ello, se debe preparar la muestra siguiendo el esquema siguiente:

Esquema de los protocolos de preparación de muestras biológicas para las distintas técnicas microscópicas.

El conjunto de etapas a las que se somete una muestra biológica para poder ser vista a través de un microscopio reciben el nombre de técnicas histológicas. El objetivo de estas técnicas es permitir la observación de las estructuras tisulares tal y como se apreciarían si se observaran los tejidos in vivo.

En el esquema se aprecian dos etapas comunes en todos los protocolos de preparación: fijación y deshidratación. La fijación es la primera etapa y la más importante del proceso histológico, consiste en mantener inalteradas las características morfológicas (forma), estructurales y de composición del tejido de tal manera que sean las más parecidas al tejido vivo. Sería como dar al botón “PAUSE” mientras vemos una película y continuar con esa imagen congelada el resto de las etapas de procesado. La fijación puede ser física (calor o frío) o química (empleándose una solución fijadora), siendo esta última la más empleada. Un ejemplo de fijador es el formol, muy conocido por su utilización en la conservación de cadáveres.

Una vez que la muestra ha sido fijada es necesario deshidratarla debido al elevado porcentaje de agua que contiene este tipo de muestras, la cual interferiría en las etapas sucesivas. La deshidratación se lleva a cabo reemplazando las moléculas de agua por alcohol o acetona.

En este momento es crucial tener claro qué información queremos obtener para así seleccionar la técnica microscópica adecuada y, por tanto, continuar el procesado de la muestra de acuerdo con ello. Como se puede observar en el esquema, existe un paralelismo entre los protocolos de preparación de las muestras utilizadas para microscopía óptica y electrónica de transmisión (TEM). Por ello, vamos a poner nuestro foco de atención en ellos para evitar extendernos demasiado en esta entrada.

Las muestras deshidratadas se incluyen en parafina o en distintos tipos de resinas; la muestra sería como ese grano de pimienta dentro de una loncha de salchichón (resina). Esto se lleva a cabo con objeto de dotar a la muestra de una consistencia suficiente para poder cortarlas en la etapa posterior. Imaginaos lo que sería intentar cortar una porción de cerebro de rata con un espesor de 1 micra (la centésima parte de un cabello humano) sin incluirlo en ese soporte, ¿no os hacéis a la idea? Pues os ayudo recurriendo de nuevo al símil charcutero, sería la diferencia entre cortar un embutido fresco (cerebro sin incluir) y cortar uno curado, mucho más fácil cortar el segundo ¿verdad?

Una vez que os he convencido de la necesidad de incluir la muestra en un soporte rígido, hay que proceder al corte de la misma. Por tanto, trasladamos la muestra a la sección de “charcutería científica”. En esta sección encontraremos distintos equipos de corte, nosotros elegiremos el equipo adecuado según el espesor del corte requerido. Los espesores de corte oscilarán desde unas micras, para óptica, a unos 100 nm, para TEM. Los cortes de 100 nm se obtienen con el ultramicrotomo y reciben el nombre de cortes ultrafinos por su pequeñísimo espesor, similar a la milésima parte de un cabello humano.

Equipos de corte de la “Charcutería científica”. A) Microtomo. B) Vibratomo. C) Criostato. D) Ultramicrotomo.

Ya tenemos nuestros ansiados cortes, pero siento deciros que aún no hemos acabado con la muestra. Tenemos los cortes con la región de interés de la muestra inalterada pero las estructuras no se pueden discernir con claridad si no sometemos a la muestra a un proceso de tinción o contrastado. En el primer caso, se tiñen las estructuras empleándose un colorante que permitirá la observación de las mismas diferenciadas con colores mediante un microscopio óptico. Mientras que la utilización de agentes de contraste (acetato de uranilo o acetato de plomo), nos proporcionará un mayor contraste de las estructuras en las imágenes de TEM.

A continuación, se muestran imágenes de bacterias tomadas empleando distintas técnicas de microscopía. En A) se observan las bacterias teñidas mediante un microscopio óptico. Las imágenes B) y C) son de microscopía electrónica, en la primera se aprecia el tamaño y forma de las bacterias mientras que en la segunda, se puede observar la ultraestructura de las mismas.

A) Imagen de bacterias tomadas por un microscopio óptico. B) Imagen de SEM de bacterias. C) Imagen de TEM de un corte ultrafino de bacerias.

Cristina Lucena Serrano

Unidad de Preparación de Muestras para Microscopía.