Resonando

La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es una técnica que se basa en el comportamiento de determinados núcleos atómicos en presencia de un campo magnético externo (imán). El análisis de muestras por esta técnica requiere que los núcleos sometidos a estudio sean magnéticamente activos; es decir que se vean afectados por un campo magnético. Estos núcleos presentan una propiedad cuántica (el espin) que en presencia del campo externo se ordena a lo largo de un determinado eje (z). La aplicación de un pulso de radiofrecuencia (RF) origina la excitación de estos espines a un nivel de mayor energía (estado excitado), sin embargo estos espines no se mantienen mucho tiempo en dicho estado y tienden a volver al estado basal (nivel de menor energía). Este proceso se conoce como relajación del núcleo y emite una energía que es la que se capta para crear los espectros de resonancia.

El resultado de estos análisis son los espectros de RMN en los que aparecen  una serie de señales situadas a una determinada posición (desplazamiento químico). La posición que ocupe cada señal va a ser dependiente del entorno químico del núcleo a analizar (de lo que se rodea). Por ello, el espectro que se obtiene es característico para cada muestra.

Figura 1: Espectro de ¹³C-RMN de la metil etil acetona.

Un espectro de RMN proporciona información a nivel cuali- y/o cuantitativo.

Con esta técnica se pueden analizar compuestos en estado líquido y en estado sólido. Sin embargo; nos vamos a centrar en la RMN de sólidos que presenta algunas diferencias con la de líquidos. La principal diferencia es que los sólidos presentan poca movilidad mientras que los líquidos tienen una alta movilidad de rotación y traslación. De tal forma que la rápida reorientación de las moléculas en presencia del campo magnético permite promediar una serie de interacciones que en el caso de los sólidos no tiene lugar. Por ello, se obtienen espectros de sólidos con señales anchas.

Figura 2: Comparativa de espectros de RMN de alanina en disolución y en sólidos.

Este inconveniente hizo que el análisis de RMN de sólidos no fuera muy popular entre los investigadores, ya que la obtención de espectros con baja resolución no les aportaba la información que necesitaban. Sin embargo, la persistencia de aquellos que pensaban que la RMN de sólidos era una buena herramienta, provocó que la búsqueda de soluciones para obtener espectros de buena calidad continuara. De tal forma que se descubrió que la rotación de las muestras en el ángulo mágico era la escucha a sus plegarias. Este ángulo tiene un valor de 54.7ᵒ con respecto al campo magnético (Figura 3A) y se comprobó que rotando las muestras en dicho ángulo se consigue un aumento de la resolución, siendo este mayor conforme la velocidad de rotación aumenta (Figura 3B). Este hecho se debe a que la rotación de las muestras en ese ángulo permite la eliminación y/o reducción de las interacciones que influyen en el ensanchamiento de las señales.

Figura 3: A) Ángulo mágico. B) Espectros obtenidos bajo la rotación del ángulo mágico.

Un ejemplo de muestras sólidas que se pueden analizar son los cementos. En el estudio de estos es de interés analizar el 27Al, debido a que según las señales que aparezcan en el espectro y la posición que ocupen se puede conocer qué tipo de aluminio tiene la muestra analizada (tetraédrico, octaédrico). También es común analizar el 29Si, ya que de manera análoga a lo que ocurre con el 27Al, podemos saber que entorno de coordinación tiene el 29Si presente en la muestra (Q1, Q2, Q3, Q4).

Figura 4: Análisis de un cemento: A) Espectro de ²⁷Al-RMN. B) Espectro de ²⁹Si-RMN.

Sin embargo, las muestras sólidas no son las únicas que se pueden analizar mediante esta técnica. También se pueden estudiar las muestras denominadas “semi-sólidas”, que se caracterizan por no ser solubles en un disolvente deuterado (disolvente necesario para medir muestras en RMN en disolución); por tanto, no se pueden analizar por RMN de líquidos. Tampoco son muestras sólidas tal y como las conocemos, es decir; no son sólidos pulverulentos ni se pueden obtener dichos sólidos molturando; de manera que tampoco se pueden medir por RMN de sólidos. Estas muestras se caracterizan porque en presencia de un disolvente deuterado (agua normalmente) se hidratan convirtiéndose en un gel (textura similar a una gelatina). Algunos ejemplos de este tipo de muestras son tejidos animales, tejidos vegetales, etc.

Para medir este tipo de muestras se recurre a la técnica de High Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS). Esta consiste en analizar las muestras en un estado semigel, lo que permite analizar nanopartículas funcionalizadas, polímeros, tejidos animales, tejidos vegetales, etc (Figura 5).

Figura 5: Espectro de ¹H-HRMAS de un polímero

La técnica HR-MAS nos proporciona un espectro de RMN que presenta una resolución mayor al de una muestra analizada por sólidos y similar al de un análisis en líquidos (Figura 6). Por tanto, se puede decir que esta técnica presenta como ventaja un aumento de la resolución en los espectros.

Figura 6: Espectros de RMN de un tejido lipoma humano: Espectro de ¹H-MAS (arriba) y espectro de ¹H-HRMAS (abajo)

Finalmente, se va a comentar el análisis de RMN de imagen (MRI) que es bien conocido debido a su amplio uso en los hospitales en el diagnóstico de enfermedades. Sin embargo, aquí nos vamos a central en el estudio de muestras de carácter material y/o biológico. El estudio de sustancias poliméricas proporciona información sobre el tamaño de poro y/o el nivel de distribución (Figura 7).

Figura 7: Imágenes de RMN de un polímero para el estudio del tamaño y distribución del poro

El análisis de muestras biológicas nos permite estudiar determinadas enfermedades y comportamientos frente a fármacos en animales pequeños (tipo roedores).  La MRI en el estudio de animales tiene la posibilidad de adquirir imágenes in vivo y de realizar una reconstrucción 3D de dichas imágenes. Existen técnicas de análisis complementarias que permiten obtener imágenes de mayor resolución, sin embargo, trabajar con animales vivos tiene como inconveniente que estos se mueven y la MRI es una técnica muy sensible al movimiento, de tal manera que los artefactos de movimientos pueden reducir la resolución de la imagen.

    A continuación, se muestran unas imágenes obtenidas por RMN de un cerebro de ratón desde distintos puntos de vista. En dichas imágenes se puede apreciar la presencia de quistes (indicados con una flecha blanca en las imágenes B y D) en el cerebro del ratón.

Figura 8: Imágenes de RMN de un cerebro de ratón

Ana Lucena Serrano

Unidad de Resonancia Magnética Nuclear de Sólidos

El secreto está en la masa

La espectrometría de masas es una técnica de análisis para compuestos orgánicos, que son los formados principalmente por C, H, O y N, además de otros elementos. Consiste en monitorizar la masa del compuesto (analito) en relación a la carga que se  incorpora suministrando un voltaje controlado a la muestra mediante una diferencia de potencial y separando las masas que son diferentes. Es una técnica destructiva por lo que al finalizar el análisis la muestra habrá desaparecido y no se podrá recuperar.

Electrospray: lugar donde se genera la diferencia de potencial aplicada a la muestra para añadirle la carga.

La espectrometría de masas (EMS por sus siglas en inglés) se utiliza para conocer los compuestos presentes en la muestra y la cantidad de los mismos. Se necesita una cantidad muy pequeña de muestra. No todos los compuestos orgánicos se pueden analizar mediante esta técnica, pero si una gran mayoría. 

Espectrómetro de Masas de alta resolución.

Debido a que los compuestos orgánicos que se pueden formar son infinitos, desde moléculas con pesos moleculares bajos como el metano, hasta moléculas con pesos moleculares elevados como las proteínas, hay que tener en cuenta algunas consideraciones a la hora de llevar a cabo el análisis. Además del tamaño, hay otros factores que influyen en un análisis químico de una muestra desconocida. Sin embargo, siempre tenemos que tener en cuenta lo siguiente:

¿QUÉ QUIERO ANALIZAR?

Antes de llevar a cabo el análisis por EMS hay que preparar la muestra. Este proceso depende completamente del analito de interés, siguiéndose distintos protocolos de preparación. Por ejemplo, para una muestra de vino podríamos escoger diferentes protocolos en función de lo que queramos analizar: el contenido de alcohol, los polifenoles, azúcares, ácidos… Además, hay que tener en cuenta que lo que queramos analizar determinará el tipo de análisis que se llevará a cabo. Este paso es fundamental, porque si la muestra no está bien preparada,  el compuesto de interés puede que no se detecte y tendríamos un falso negativo.

¿QUÉ TIENE MI MUESTRA?

En casi todos los casos, el analito de interés se encuentra en la muestra en forma de mezcla,  por lo que tenemos que separarlo. Hay dos formas de separarlo del resto de sustancias presentes que no nos interesan: en la etapa de preparación de muestra o en el propio equipo que va a medir. En este último caso, se denominan técnicas acopladas de cromatografía y espectrometría de masas. Cuando se utiliza la cromatografía (existen varios tipos que se eligen en función de las características del analito) se utiliza una columna para separar los compuestos. La columna es un “tubo” de diferente tamaño y diámetro que contiene un relleno en el interior que influye en la separación que se lleve a cabo. También puede afectar lo que haya en la mezcla, ya que puede haber compuestos que inhiban la adición de la carga necesaria para medir la masa y entonces esa muestra no se podría medir.

Espectrómetros de masas acoplados a cromatógrafos: a) Cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas de baja resolución. b) Cromatógrafo de líquidos acoplado a espectrómetro de masas de alta resolución.

Cuando analizamos por la técnica de EMS, obtenemos lo que llamamos un espectro de masas en el que se ven representadas las masas en forma de gráfico de barras y que constituyen la huella dactilar de los compuestos analizados. Dependiendo del tipo de espectrómetro de masas que tengamos, se pueden obtener dos tipos de espectros. Si usamos un equipo de baja resolución, vemos un espectro con varias barras con distintas masas y dos decimales que se obtienen al “romper” la molécula con una energía fija de 70 eV. Lo que se observan, por tanto, son fragmentos del compuesto de interés. El valor de energía es fijo para todos los equipos porque así se puede obtener siempre el mismo espectro para el mismo compuesto y los podremos comparar. Estos espectros se guardan en bibliotecas que se comparten en todo el mundo. Si se utiliza un espectrómetro de masas de alta resolución, se obtiene un gráfico de barras pero con un valor de masa de cinco decimales que se corresponde con la masa del compuesto completo +1, ya que al añadir la carga, en este caso se suele añadir en forma de un átomo de hidrógeno con carga positiva (H⁺¹). Este espectro también es como una huella dactilar del compuesto, aunque en este caso si sería la misma para todos los compuestos que tengan el mismo número de átomos de los elementos que lo formen. Con esta técnica, no podemos distinguir cómo se han ordenado los átomos para formar el compuesto.

 Espectros de masas. A la izquierda se representa un espectro de masas de baja resolución (sólo dos decimales y se ven los fragmentos del compuesto de interés). A la derecha se ve un espectro de masas de alta resolución en el que se compara el valor experimental y teórico con cinco decimales y la masa del compuesto completo.

Para qué se utiliza la Espectrometría de Masas:

Dependiendo del tipo de acoplamiento que tengamos, las aplicaciones serán diferentes. En el caso de la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas se analizan compuestos orgánicos volátiles, tiene diversas aplicaciones en el mundo industrial: por ejemplo conocer la composición de las fracciones volátiles del petróleo, análisis de contaminantes en agua, seguimiento de reacciones químicas y conocimiento del grado de pureza de compuestos químicos. También se utiliza en análisis de azúcares en extractos vegetales y análisis de algunas drogas. En el caso de la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas se puede utilizar para análisis de muestras biológicas, como la presencia de medicamentos en sangre u órganos, análisis de contaminantes en aguas, análisis de pesticidas etc.

A continuación presentamos algunos ejemplos de análisis realizados en la unidad de EMS del SCAI:

Compuestos volátiles en fresas:

Desde hace un par de años, se están midiendo numerosos compuestos volátiles presentes en las fresas. Se utiliza un cromatógrafo de gases para poder separarlos todos. En este caso, la preparación de la muestra es mínima, ya que el equipo dispone de un sistema de introducción de muestra que consiste en calentar la fresa triturada, mientras una fibra con un adsorbente se introduce en el vial (bote que contiene la muestra). Los compuestos se adhieren a esa superficie y después se desorben en el equipo para que circulen por la columna y se separen. Al final del análisis, el resultado que se obtiene es el conocimiento de los volátiles presentes y su cantidad. El objetivo es medir una serie de volátiles en fresa y otros frutos rojos que son responsables del aroma del fruto, y por lo tanto es una característica organoléptica importante, apreciada por los consumidores. En una segunda parte, se asociaran los volátiles medidos con técnicas genómicas, para identificar y validar genes responsables de la síntesis de esos volátiles. Esto podría ayudar a mejorar la selección de variedades de fresa con 'un aroma perfeccionado'.

Análisis de medicamentos:

Utilizando la técnica de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas se ha determinado la cantidad de distintos medicamentos presentes en muestras biológicas. Algunos de los medicamentos ensayados han sido: amoxicilina, ácido amoxicilóico, dicetopiperacina y la hidroxicloroquina (utilizada en el tratamiento de la malaria y el lupus). En estos casos, la preparación de la muestra es un proceso más largo, ya que se hace necesaria la eliminación de compuestos que puedan interferir tanto en la ionización del analito (adición de la carga) como en la detección del mismo por problemas de contaminación. En estos casos se evalúa tanto la presencia o ausencia del medicamento como la cantidad detectada.

A la izquierda un ejemplo de pastillas de amoxicilina. A la derecha la molécula de hidroxicloroquina.

Análisis de pesticidas en agua:

También se ha analizado la presencia de glifosato y malatión en muestras acuosas. Estas sustancias son herbicidas con efectos nocivos y se está investigando cómo reducir la presencia de los mismos en diversas muestras. En este caso, se ensayaron muestras de agua tratadas con diferentes métodos para eliminar la presencia de estos herbicidas. Se quería comprobar tanto la reducción en la concentración como la eliminación de los mismos. Los resultados obtenidos fueron satisfactorios. Además, se podría analizar la presencia de estos pesticidas en las propias plantas y en el suelo en el que crecen para realizar así un estudio más completo de su presencia.

Como se puede observar, la técnica de EMS es muy versátil pudiendo analizar una cantidad muy elevada de compuestos en distintas muestras.

Sara Fernández-Palacios Campos

Unidad Espectrometría de Masas