Plantas a la carta

    El cultivo in vitro de tejidos vegetales incluye una serie de técnicas en las que un trocito de tejido cultivado en asepsia y llamado explanto, mediante condiciones controladas puede llegar a generar una planta clónica igual que la planta madre de la que procede.

    Esta técnica se basa en la capacidad de las células vegetales de regenerar una planta completa mediante la influencia de reguladores de crecimiento (fitohormonas) que se añaden al medio de cultivo (auxinas y citoquininas). Una proporción hormonal adecuada de ambas hace que las células diferenciadas (células con forma y función específica) se desdiferencien y se vuelvan células totipotentes, así se desarrollan las células madres de las plantas.

    En función de los reguladores de crecimiento que se añadan al medio podemos obtener de esas células: tallos, raíces, embriones, callo, etc… Concretamente, el callo es una estructura vegetal tipo tumor, de crecimiento activo, con células en diferente estadío de diferenciación, que pueden regenerar órganos vegetales e incluso embriones para formar semillas artificiales. Es como si de un trocito de piel humana que se pusiera en medio de cultivo adecuado, se desdiferenciasen sus células en un aglomerado de células madres y regenerasen en embriones y, por lo tanto, clones humanos.

    Por otro lado, tenemos a la bacteria fitopatógena Agrobacterium tumefaciens. Su forma de infectar a las plantas resulta muy interesante para la biotecnología, ya que es capaz de insertar en el genoma de las células vegetales una parte de su DNA del plásmido llamado T-DNA (DNA transferente) haciendo que las células fabriquen para la bacteria alimentos y esta pueda vivir de forma parasitaria en ellas.

    Aprovechando la capacidad de regenerar una planta completa a partir de una célula vegetal somática, y las características especiales de Agrobacterium como vehículo de transporte de genes, podemos insertar genes foráneos de interés en el genoma vegetal artificialmente, ya que de forma natural sería impensable. Esta es una metodología que se realiza en el Servicio de cultivo de plantas de los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación. Es muy usada y extendida para la mejora genética vegetal (obtención de plantas transgénicas) pudiendo insertar en plantas genes de la misma especie, otras especies e incluso de animales, bacterias, etc.

    Para ello hay que manipular el plásmido de Agrobacterium, introduciéndole la secuencia del gen que nos interesa estudiar in vivo, además de un gen chivato o de resistencia a alguna sustancia (normalmente antibióticos). Esta mejora extra les posibilitará la selección de las células que han adquirido el T-DNA y se multiplicarán en el medio específico frente a las que no lo tengan, que terminarán muriendo. En otros casos se incluye también la GFP, proteína fluorescente verde de una medusa que hace que los callos sean fluorescentes cuando se ilumina con luz azul permitiendo su selección in situ.

    Cuando está todo preparado, se ponen en contacto los explantos con Agrobacterium. Después de sucesivos cambios de medio de cultivo (subcultivos) y eliminar Agrobacterium de los explantos, comenzarán a regenerar callo y finalmente tallo que tendrán los nuevos genes insertados. Este tallo se pone en un medio de enraizamiento, y ya tenemos una planta igual que la planta madre, pero con las características adquiridas del nuevo gen.

    La confirmación definitiva se realiza mediante PCR, amplificando un fragmento del transgen. Solo queda pasarla al invernadero y ver si funciona. El gen foráneo, si es de la misma planta, puede sobreexpresar esa característica o puede silenciarla. Cuando es de otro organismo se le puede conferir una característica nueva nunca antes conseguida.

Ventajas de la metodología:

• El bajo coste que tiene el material que se emplea (material vidrio reutilizable) y aparatos.
• Se pueden conseguir plantas con características mejoradas en 2 años en el laboratorio si el experimento marcha bien. Pese a lo que pueda parecer, es una gran reducción de tiempo si lo comparamos con los programas de mejora genética clásica que pueden llegar a tardar incluso décadas.
• Este tipo de mejora genética está sometido a controles muy exhaustivos antes de salir al mercado, aunque su principal uso es para investigación.

También tiene sus inconvenientes:

• Los protocolos deben estar puestos a punto, llevando años de experimentos para conseguirlos.
• Es una metodología muy laboriosa. Los medios de cultivo, que se deben preparar en cada momento, son muy variados en función de la planta y el proceso de morfogénesis en el que se encuentre. Es necesario tener el material vegetal en condiciones óptimas llevando a cabo un mantenimiento constante. Cualquier contaminación o subida de temperatura de la cámara tira a la basura años de trabajo.
• Agrobacterium se inserta al azar en el genoma de cada célula, pudiendo afectar, según donde se inserte, a cualquier aspecto morfológico o fisiológico de la planta, llegando a no ser funcional y morir. Esto requiere generar en un experimento de transformación muchísimas líneas diferentes para garantizar su éxito.
• La bacteria solo infecta dicotiledóneas, por lo que también se utiliza otra metodología que dispara -literalmente- la secuencia genética de interés al genoma de la planta mediante una pistola de genes. Es lo que se conoce como biolística, también (mal) llamada biobalística.

    Estos inconvenientes hacen que la obtención de plantas transgénicas sea uno de los cuellos de botella de la mejora genética dirigida. La gran variabilidad que hay en los protocolos, los cambios que hay que realizar en función del proceso de morfogénesis que se encuentre el explanto (a ojo de buen cubero) y la dificultad de reproducirlos en muchas ocasiones en el laboratorio hace que esta metodología dé más de un quebradero de cabeza.

    Hay otros métodos de transformación genética, aunque este es uno de los más usados y efectivos. De esta forma se han obtenido plantas con resistencia a insectos, enfermedades, hongos; otras que crecen el doble de rápido; resistente a herbicidas; fruta que mejora sus características organolépticas (sabor, textura) y prolongan su tiempo de postcosecha, fruto que se emplea como vacuna al ingerirlo, modificación de la forma y color de la flor, etc. Es la forma de obtener y diseñar plantas a la carta.

Lara Silvia Jiménez Bermúdez

Unidad de Cultivo de Plantas

Charcutería científica

La limitación del ojo humano sólo nos deja ver aquello que tenga un tamaño no inferior a una décima de milímetro. Por suerte, los microscopios solventarán esta limitación y nos permitirán ver cosas que no podemos apreciar a simple vista. En esta entrada no voy a describir el funcionamiento de los microscopios, sino que me voy a centrar en explicar cómo deben ser preparadas las muestras para poder ser vistas a un microscopio.

¿POR QUÉ SE DEBEN PROCESAR LAS MUESTRAS?

La mayoría de estructuras celulares y tisulares (células y tejidos) no se pueden apreciar con nuestros ojos debido al “limitado” poder de resolución de los mismos, teniéndose que utilizar microscopios para ello. Los tejidos tampoco presentan contraste suficiente para que se puedan discriminar estas estructuras con facilidad. Por todo ello las muestras han de ser procesadas previamente para evitar su deterioro y poder resaltar las estructuras que queremos estudiar en profundidad. Esto mismo ocurre con las estructuras nanométricas de las muestras materiales.

Se podría decir que existen tantos protocolos de preparación como muestras diferentes. La elección de un protocolo u otro va a depender de:

- Tipo de muestra. Podríamos clasificar las diferentes muestras en función de su naturaleza: materiales o biológicas. Aunque quiero destacar que no todas las muestras biológicas (tejido animal, vegetal, nervioso, microbiológico…) se preparan empleando protocolos idénticos.

- Técnica microscópica empleada. Según la información que queramos obtener de la muestra emplearemos una técnica microscópica u otra. En función de esta técnica, las muestras se prepararán siguiendo un protocolo u otro.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

Para profundizar en el tema, nos vamos a centrar en la preparación de muestras biológicas y obviaremos a las muestras materiales. Vamos a suponer que hemos recibido una muestra de bacterias y que el usuario quiere obtener tanto imágenes de microscopía óptica como de microscopía electrónica (transmisión y barrido) de ella. Para ello, se debe preparar la muestra siguiendo el esquema siguiente:

Esquema de los protocolos de preparación de muestras biológicas para las distintas técnicas microscópicas.

El conjunto de etapas a las que se somete una muestra biológica para poder ser vista a través de un microscopio reciben el nombre de técnicas histológicas. El objetivo de estas técnicas es permitir la observación de las estructuras tisulares tal y como se apreciarían si se observaran los tejidos in vivo.

En el esquema se aprecian dos etapas comunes en todos los protocolos de preparación: fijación y deshidratación. La fijación es la primera etapa y la más importante del proceso histológico, consiste en mantener inalteradas las características morfológicas (forma), estructurales y de composición del tejido de tal manera que sean las más parecidas al tejido vivo. Sería como dar al botón “PAUSE” mientras vemos una película y continuar con esa imagen congelada el resto de las etapas de procesado. La fijación puede ser física (calor o frío) o química (empleándose una solución fijadora), siendo esta última la más empleada. Un ejemplo de fijador es el formol, muy conocido por su utilización en la conservación de cadáveres.

Una vez que la muestra ha sido fijada es necesario deshidratarla debido al elevado porcentaje de agua que contiene este tipo de muestras, la cual interferiría en las etapas sucesivas. La deshidratación se lleva a cabo reemplazando las moléculas de agua por alcohol o acetona.

En este momento es crucial tener claro qué información queremos obtener para así seleccionar la técnica microscópica adecuada y, por tanto, continuar el procesado de la muestra de acuerdo con ello. Como se puede observar en el esquema, existe un paralelismo entre los protocolos de preparación de las muestras utilizadas para microscopía óptica y electrónica de transmisión (TEM). Por ello, vamos a poner nuestro foco de atención en ellos para evitar extendernos demasiado en esta entrada.

Las muestras deshidratadas se incluyen en parafina o en distintos tipos de resinas; la muestra sería como ese grano de pimienta dentro de una loncha de salchichón (resina). Esto se lleva a cabo con objeto de dotar a la muestra de una consistencia suficiente para poder cortarlas en la etapa posterior. Imaginaos lo que sería intentar cortar una porción de cerebro de rata con un espesor de 1 micra (la centésima parte de un cabello humano) sin incluirlo en ese soporte, ¿no os hacéis a la idea? Pues os ayudo recurriendo de nuevo al símil charcutero, sería la diferencia entre cortar un embutido fresco (cerebro sin incluir) y cortar uno curado, mucho más fácil cortar el segundo ¿verdad?

Una vez que os he convencido de la necesidad de incluir la muestra en un soporte rígido, hay que proceder al corte de la misma. Por tanto, trasladamos la muestra a la sección de “charcutería científica”. En esta sección encontraremos distintos equipos de corte, nosotros elegiremos el equipo adecuado según el espesor del corte requerido. Los espesores de corte oscilarán desde unas micras, para óptica, a unos 100 nm, para TEM. Los cortes de 100 nm se obtienen con el ultramicrotomo y reciben el nombre de cortes ultrafinos por su pequeñísimo espesor, similar a la milésima parte de un cabello humano.

Equipos de corte de la “Charcutería científica”. A) Microtomo. B) Vibratomo. C) Criostato. D) Ultramicrotomo.

Ya tenemos nuestros ansiados cortes, pero siento deciros que aún no hemos acabado con la muestra. Tenemos los cortes con la región de interés de la muestra inalterada pero las estructuras no se pueden discernir con claridad si no sometemos a la muestra a un proceso de tinción o contrastado. En el primer caso, se tiñen las estructuras empleándose un colorante que permitirá la observación de las mismas diferenciadas con colores mediante un microscopio óptico. Mientras que la utilización de agentes de contraste (acetato de uranilo o acetato de plomo), nos proporcionará un mayor contraste de las estructuras en las imágenes de TEM.

A continuación, se muestran imágenes de bacterias tomadas empleando distintas técnicas de microscopía. En A) se observan las bacterias teñidas mediante un microscopio óptico. Las imágenes B) y C) son de microscopía electrónica, en la primera se aprecia el tamaño y forma de las bacterias mientras que en la segunda, se puede observar la ultraestructura de las mismas.

A) Imagen de bacterias tomadas por un microscopio óptico. B) Imagen de SEM de bacterias. C) Imagen de TEM de un corte ultrafino de bacerias.

Cristina Lucena Serrano

Unidad de Preparación de Muestras para Microscopía.

Resonando

La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es una técnica que se basa en el comportamiento de determinados núcleos atómicos en presencia de un campo magnético externo (imán). El análisis de muestras por esta técnica requiere que los núcleos sometidos a estudio sean magnéticamente activos; es decir que se vean afectados por un campo magnético. Estos núcleos presentan una propiedad cuántica (el espin) que en presencia del campo externo se ordena a lo largo de un determinado eje (z). La aplicación de un pulso de radiofrecuencia (RF) origina la excitación de estos espines a un nivel de mayor energía (estado excitado), sin embargo estos espines no se mantienen mucho tiempo en dicho estado y tienden a volver al estado basal (nivel de menor energía). Este proceso se conoce como relajación del núcleo y emite una energía que es la que se capta para crear los espectros de resonancia.

El resultado de estos análisis son los espectros de RMN en los que aparecen  una serie de señales situadas a una determinada posición (desplazamiento químico). La posición que ocupe cada señal va a ser dependiente del entorno químico del núcleo a analizar (de lo que se rodea). Por ello, el espectro que se obtiene es característico para cada muestra.

Figura 1: Espectro de ¹³C-RMN de la metil etil acetona.

Un espectro de RMN proporciona información a nivel cuali- y/o cuantitativo.

Con esta técnica se pueden analizar compuestos en estado líquido y en estado sólido. Sin embargo; nos vamos a centrar en la RMN de sólidos que presenta algunas diferencias con la de líquidos. La principal diferencia es que los sólidos presentan poca movilidad mientras que los líquidos tienen una alta movilidad de rotación y traslación. De tal forma que la rápida reorientación de las moléculas en presencia del campo magnético permite promediar una serie de interacciones que en el caso de los sólidos no tiene lugar. Por ello, se obtienen espectros de sólidos con señales anchas.

Figura 2: Comparativa de espectros de RMN de alanina en disolución y en sólidos.

Este inconveniente hizo que el análisis de RMN de sólidos no fuera muy popular entre los investigadores, ya que la obtención de espectros con baja resolución no les aportaba la información que necesitaban. Sin embargo, la persistencia de aquellos que pensaban que la RMN de sólidos era una buena herramienta, provocó que la búsqueda de soluciones para obtener espectros de buena calidad continuara. De tal forma que se descubrió que la rotación de las muestras en el ángulo mágico era la escucha a sus plegarias. Este ángulo tiene un valor de 54.7ᵒ con respecto al campo magnético (Figura 3A) y se comprobó que rotando las muestras en dicho ángulo se consigue un aumento de la resolución, siendo este mayor conforme la velocidad de rotación aumenta (Figura 3B). Este hecho se debe a que la rotación de las muestras en ese ángulo permite la eliminación y/o reducción de las interacciones que influyen en el ensanchamiento de las señales.

Figura 3: A) Ángulo mágico. B) Espectros obtenidos bajo la rotación del ángulo mágico.

Un ejemplo de muestras sólidas que se pueden analizar son los cementos. En el estudio de estos es de interés analizar el 27Al, debido a que según las señales que aparezcan en el espectro y la posición que ocupen se puede conocer qué tipo de aluminio tiene la muestra analizada (tetraédrico, octaédrico). También es común analizar el 29Si, ya que de manera análoga a lo que ocurre con el 27Al, podemos saber que entorno de coordinación tiene el 29Si presente en la muestra (Q1, Q2, Q3, Q4).

Figura 4: Análisis de un cemento: A) Espectro de ²⁷Al-RMN. B) Espectro de ²⁹Si-RMN.

Sin embargo, las muestras sólidas no son las únicas que se pueden analizar mediante esta técnica. También se pueden estudiar las muestras denominadas “semi-sólidas”, que se caracterizan por no ser solubles en un disolvente deuterado (disolvente necesario para medir muestras en RMN en disolución); por tanto, no se pueden analizar por RMN de líquidos. Tampoco son muestras sólidas tal y como las conocemos, es decir; no son sólidos pulverulentos ni se pueden obtener dichos sólidos molturando; de manera que tampoco se pueden medir por RMN de sólidos. Estas muestras se caracterizan porque en presencia de un disolvente deuterado (agua normalmente) se hidratan convirtiéndose en un gel (textura similar a una gelatina). Algunos ejemplos de este tipo de muestras son tejidos animales, tejidos vegetales, etc.

Para medir este tipo de muestras se recurre a la técnica de High Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS). Esta consiste en analizar las muestras en un estado semigel, lo que permite analizar nanopartículas funcionalizadas, polímeros, tejidos animales, tejidos vegetales, etc (Figura 5).

Figura 5: Espectro de ¹H-HRMAS de un polímero

La técnica HR-MAS nos proporciona un espectro de RMN que presenta una resolución mayor al de una muestra analizada por sólidos y similar al de un análisis en líquidos (Figura 6). Por tanto, se puede decir que esta técnica presenta como ventaja un aumento de la resolución en los espectros.

Figura 6: Espectros de RMN de un tejido lipoma humano: Espectro de ¹H-MAS (arriba) y espectro de ¹H-HRMAS (abajo)

Finalmente, se va a comentar el análisis de RMN de imagen (MRI) que es bien conocido debido a su amplio uso en los hospitales en el diagnóstico de enfermedades. Sin embargo, aquí nos vamos a central en el estudio de muestras de carácter material y/o biológico. El estudio de sustancias poliméricas proporciona información sobre el tamaño de poro y/o el nivel de distribución (Figura 7).

Figura 7: Imágenes de RMN de un polímero para el estudio del tamaño y distribución del poro

El análisis de muestras biológicas nos permite estudiar determinadas enfermedades y comportamientos frente a fármacos en animales pequeños (tipo roedores).  La MRI en el estudio de animales tiene la posibilidad de adquirir imágenes in vivo y de realizar una reconstrucción 3D de dichas imágenes. Existen técnicas de análisis complementarias que permiten obtener imágenes de mayor resolución, sin embargo, trabajar con animales vivos tiene como inconveniente que estos se mueven y la MRI es una técnica muy sensible al movimiento, de tal manera que los artefactos de movimientos pueden reducir la resolución de la imagen.

    A continuación, se muestran unas imágenes obtenidas por RMN de un cerebro de ratón desde distintos puntos de vista. En dichas imágenes se puede apreciar la presencia de quistes (indicados con una flecha blanca en las imágenes B y D) en el cerebro del ratón.

Figura 8: Imágenes de RMN de un cerebro de ratón

Ana Lucena Serrano

Unidad de Resonancia Magnética Nuclear de Sólidos

El secreto está en la masa

La espectrometría de masas es una técnica de análisis para compuestos orgánicos, que son los formados principalmente por C, H, O y N, además de otros elementos. Consiste en monitorizar la masa del compuesto (analito) en relación a la carga que se  incorpora suministrando un voltaje controlado a la muestra mediante una diferencia de potencial y separando las masas que son diferentes. Es una técnica destructiva por lo que al finalizar el análisis la muestra habrá desaparecido y no se podrá recuperar.

Electrospray: lugar donde se genera la diferencia de potencial aplicada a la muestra para añadirle la carga.

La espectrometría de masas (EMS por sus siglas en inglés) se utiliza para conocer los compuestos presentes en la muestra y la cantidad de los mismos. Se necesita una cantidad muy pequeña de muestra. No todos los compuestos orgánicos se pueden analizar mediante esta técnica, pero si una gran mayoría. 

Espectrómetro de Masas de alta resolución.

Debido a que los compuestos orgánicos que se pueden formar son infinitos, desde moléculas con pesos moleculares bajos como el metano, hasta moléculas con pesos moleculares elevados como las proteínas, hay que tener en cuenta algunas consideraciones a la hora de llevar a cabo el análisis. Además del tamaño, hay otros factores que influyen en un análisis químico de una muestra desconocida. Sin embargo, siempre tenemos que tener en cuenta lo siguiente:

¿QUÉ QUIERO ANALIZAR?

Antes de llevar a cabo el análisis por EMS hay que preparar la muestra. Este proceso depende completamente del analito de interés, siguiéndose distintos protocolos de preparación. Por ejemplo, para una muestra de vino podríamos escoger diferentes protocolos en función de lo que queramos analizar: el contenido de alcohol, los polifenoles, azúcares, ácidos… Además, hay que tener en cuenta que lo que queramos analizar determinará el tipo de análisis que se llevará a cabo. Este paso es fundamental, porque si la muestra no está bien preparada,  el compuesto de interés puede que no se detecte y tendríamos un falso negativo.

¿QUÉ TIENE MI MUESTRA?

En casi todos los casos, el analito de interés se encuentra en la muestra en forma de mezcla,  por lo que tenemos que separarlo. Hay dos formas de separarlo del resto de sustancias presentes que no nos interesan: en la etapa de preparación de muestra o en el propio equipo que va a medir. En este último caso, se denominan técnicas acopladas de cromatografía y espectrometría de masas. Cuando se utiliza la cromatografía (existen varios tipos que se eligen en función de las características del analito) se utiliza una columna para separar los compuestos. La columna es un “tubo” de diferente tamaño y diámetro que contiene un relleno en el interior que influye en la separación que se lleve a cabo. También puede afectar lo que haya en la mezcla, ya que puede haber compuestos que inhiban la adición de la carga necesaria para medir la masa y entonces esa muestra no se podría medir.

Espectrómetros de masas acoplados a cromatógrafos: a) Cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas de baja resolución. b) Cromatógrafo de líquidos acoplado a espectrómetro de masas de alta resolución.

Cuando analizamos por la técnica de EMS, obtenemos lo que llamamos un espectro de masas en el que se ven representadas las masas en forma de gráfico de barras y que constituyen la huella dactilar de los compuestos analizados. Dependiendo del tipo de espectrómetro de masas que tengamos, se pueden obtener dos tipos de espectros. Si usamos un equipo de baja resolución, vemos un espectro con varias barras con distintas masas y dos decimales que se obtienen al “romper” la molécula con una energía fija de 70 eV. Lo que se observan, por tanto, son fragmentos del compuesto de interés. El valor de energía es fijo para todos los equipos porque así se puede obtener siempre el mismo espectro para el mismo compuesto y los podremos comparar. Estos espectros se guardan en bibliotecas que se comparten en todo el mundo. Si se utiliza un espectrómetro de masas de alta resolución, se obtiene un gráfico de barras pero con un valor de masa de cinco decimales que se corresponde con la masa del compuesto completo +1, ya que al añadir la carga, en este caso se suele añadir en forma de un átomo de hidrógeno con carga positiva (H⁺¹). Este espectro también es como una huella dactilar del compuesto, aunque en este caso si sería la misma para todos los compuestos que tengan el mismo número de átomos de los elementos que lo formen. Con esta técnica, no podemos distinguir cómo se han ordenado los átomos para formar el compuesto.

 Espectros de masas. A la izquierda se representa un espectro de masas de baja resolución (sólo dos decimales y se ven los fragmentos del compuesto de interés). A la derecha se ve un espectro de masas de alta resolución en el que se compara el valor experimental y teórico con cinco decimales y la masa del compuesto completo.

Para qué se utiliza la Espectrometría de Masas:

Dependiendo del tipo de acoplamiento que tengamos, las aplicaciones serán diferentes. En el caso de la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas se analizan compuestos orgánicos volátiles, tiene diversas aplicaciones en el mundo industrial: por ejemplo conocer la composición de las fracciones volátiles del petróleo, análisis de contaminantes en agua, seguimiento de reacciones químicas y conocimiento del grado de pureza de compuestos químicos. También se utiliza en análisis de azúcares en extractos vegetales y análisis de algunas drogas. En el caso de la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas se puede utilizar para análisis de muestras biológicas, como la presencia de medicamentos en sangre u órganos, análisis de contaminantes en aguas, análisis de pesticidas etc.

A continuación presentamos algunos ejemplos de análisis realizados en la unidad de EMS del SCAI:

Compuestos volátiles en fresas:

Desde hace un par de años, se están midiendo numerosos compuestos volátiles presentes en las fresas. Se utiliza un cromatógrafo de gases para poder separarlos todos. En este caso, la preparación de la muestra es mínima, ya que el equipo dispone de un sistema de introducción de muestra que consiste en calentar la fresa triturada, mientras una fibra con un adsorbente se introduce en el vial (bote que contiene la muestra). Los compuestos se adhieren a esa superficie y después se desorben en el equipo para que circulen por la columna y se separen. Al final del análisis, el resultado que se obtiene es el conocimiento de los volátiles presentes y su cantidad. El objetivo es medir una serie de volátiles en fresa y otros frutos rojos que son responsables del aroma del fruto, y por lo tanto es una característica organoléptica importante, apreciada por los consumidores. En una segunda parte, se asociaran los volátiles medidos con técnicas genómicas, para identificar y validar genes responsables de la síntesis de esos volátiles. Esto podría ayudar a mejorar la selección de variedades de fresa con 'un aroma perfeccionado'.

Análisis de medicamentos:

Utilizando la técnica de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas se ha determinado la cantidad de distintos medicamentos presentes en muestras biológicas. Algunos de los medicamentos ensayados han sido: amoxicilina, ácido amoxicilóico, dicetopiperacina y la hidroxicloroquina (utilizada en el tratamiento de la malaria y el lupus). En estos casos, la preparación de la muestra es un proceso más largo, ya que se hace necesaria la eliminación de compuestos que puedan interferir tanto en la ionización del analito (adición de la carga) como en la detección del mismo por problemas de contaminación. En estos casos se evalúa tanto la presencia o ausencia del medicamento como la cantidad detectada.

A la izquierda un ejemplo de pastillas de amoxicilina. A la derecha la molécula de hidroxicloroquina.

Análisis de pesticidas en agua:

También se ha analizado la presencia de glifosato y malatión en muestras acuosas. Estas sustancias son herbicidas con efectos nocivos y se está investigando cómo reducir la presencia de los mismos en diversas muestras. En este caso, se ensayaron muestras de agua tratadas con diferentes métodos para eliminar la presencia de estos herbicidas. Se quería comprobar tanto la reducción en la concentración como la eliminación de los mismos. Los resultados obtenidos fueron satisfactorios. Además, se podría analizar la presencia de estos pesticidas en las propias plantas y en el suelo en el que crecen para realizar así un estudio más completo de su presencia.

Como se puede observar, la técnica de EMS es muy versátil pudiendo analizar una cantidad muy elevada de compuestos en distintas muestras.

Sara Fernández-Palacios Campos

Unidad Espectrometría de Masas

Abre los ojos

Los humanos somos entes imperfectos, es verdad que hemos conseguido reproducirnos con éxito y conquistar el planeta, pero eso solo nos convierte en los más capaces de nuestro barrio: la Tierra. Si analizamos desde una perspectiva más amplia, más universal, lo cierto es que como humanos adolecemos de muchas cualidades, y aquí vamos a tratar de una de nuestras grandes limitaciones: la vista.

 La capacidad de distinguir con nitidez dos puntos muy cercanos en el espacio es lo que se denomina capacidad o poder de resolución. El ojo humano, sin ayuda, es capaz de resolver o distinguir dos puntos separados no menos de una décima de milímetro (el grosor de un cabello). Para traspasar esta barrera utilizamos lupas y microscopios ópticos que, mediante la adecuada combinación de lentes, desvían los rayos de luz de forma que los contornos de los objetos lleguen aumentados a nuestros ojos. Con ellos podemos observar detalles mucho más pequeños de lo que la vista nos permite, pero también tienen sus límites físicos.

La luz que se refleja en los objetos llega a los fotorreceptores de nuestras retinas, generando una serie de impulsos nerviosos que el cerebro interpreta como formas. Ese chivato (la luz) que nos ayuda a distinguir formas y colores, no es más que una pequeña parte del espectro electromagnético: la región comprendida entre los 700 y los 400 nanómetros. Y son estas longitudes de onda las que limitan la capacidad de aumento de un microscopio óptico, o mejor dicho, su resolución. No podemos resolver detalles menores a la dimensión del patrón que utilizamos para medir.

Rango de longitudes de onda de la luz dentro del espectro electromagnético

Un nanómetro es la milmillonésima parte de un metro, y los microscopios ópticos (con sus 400 nm de resolución) son suficientes para observar multitud de cosas minúsculas, pero muchas otras quedan fuera de su alcance. Un virus, por ejemplo, tiene un tamaño que oscila entre los 350 y los 20 nm. Se necesita otro tipo de instrumento para verlos, y aquí es donde llegamos al microscopio electrónico de transmisión (al que nos referiremos como TEM, por sus siglas en ingles).

Distintos tipos de virus con sus dimensiones comparadas

Un TEM es como un microscopio óptico, solo que en vez de luz utilizamos un haz de electrones acelerado por una gran diferencia de potencial eléctrico, normalmente entre 80 y 300 kilovoltios. El secreto de la resolución alcanzada por estos equipos reside por tanto en que ese haz de electrones se comporta como una onda, como la luz. Se trata del efecto onda-corpúsculo postulado en mecánica cuántica, según el cual los electrones se comportan no solo como partículas, sino también como una onda. La gran ventaja de los electrones frente a la luz es que sus longitudes de onda son del orden de 100.000 veces más pequeñas, lo que nos permite tal poder de resolución que podemos incluso resolver individualmente los átomos que constituyen la materia.

Átomos de una lámina de oro (izquierda) y monocapas atómicas de un nanotubo de carbono (derecha)

Es tal la capacidad de un TEM para adentrarse en lo más profundo de la materia, que el tamaño de la muestra a observar debe ser muy pequeño, minúsculo. No puede ser mayor que el soporte utilizado, un pequeño disco de 3 mm de diámetro. Otro requisito adicional es que la muestra debe ser muy fina para poder ser atravesada por el haz de electrones, de un espesor inferior a los 100 nm (la milésima parte del grosor de un cabello). De hecho, la preparación de muestras para TEM es una disciplina compleja que requiere personal cualificado para poder obtener la máxima capacidad del microscopio.

Soporte de muestras para TEM

El poder de resolución es importante, pero si de los mismos electrones aprovechamos también su naturaleza corpuscular, se pueden extraer toda una serie de señales secundarias debido a la interacción de estos con las partículas de la muestra. Cada una de las señales extraídas de dicha interacción proporciona información adicional sobre la naturaleza de la muestra, y esa información puede ser mapeada o localizada sobre la imagen de la misma. De esta forma podemos observar su estructura física y química a escala nanométrica.

Imágenes de TEM con superposición de información suministrada por la emisión de rayos-X

En el SCAI disponemos de dos TEM, un equipo convencional optimizado para observación de muestras biológicas y otro de alta resolución preparado para observar y caracterizar materiales sintéticos y nanoestructurados (metamateriales).

Microscopios TEM Jeol JEM-1400 (izquierda) y FEI Talos F200X (derecha)

En nuestras instalaciones se llevan a cabo investigaciones de campos muy diversos, como estudios sobre enfermedades neurodegenerativas, optimización de cultivos, producción de biomateriales y biocombustibles, catalizadores para producción de energía y productos químicos, biomarcadores médicos, paneles solares, etc. A continuación mostramos unos ejemplos de las imágenes obtenidas en estos equipos.

Capilar sanguíneo, eritrocitos, mitocondrias, axones (imagen coloreada)

Nanopartículas core-shell de oro recubiertas de plata (mapa EDX superpuesto)

Ordenamiento atómico y defectos cristalinos en lámina de ZnO

Tomografía TEM 3D de material catalítico con nanopartículas de Fe

Todas estas maravillas se encuentran ocultas a la limitada visión humana, pero afortunadamente nuestra capacidad de imaginación no tiene límites y hemos conseguido superar las barreras que nos impedían su observación. La ciencia y la tecnología son ese rompehielos que nos abre el camino hacia terrenos anteriormente vedados a nuestro conocimiento. Así que abre los ojos, hay muchos mundos que descubrir todavía.

Adolfo Martínez Orellana (Unidad de TEM)

El detective invisible

A finales del siglo XIX, en 1895, Wilhelm Conrad Röntgen, científico alemán, descubrió una radiación a la que llamó Rayos-X por tener un origen desconocido. Esta radiación tenía la propiedad de penetrar lo cuerpos opacos. La importancia de su descubrimiento fue tal en su día, que llevó a Röntgen a ser el primer ganador del Premio Nobel de Física en 1901.

Como sabemos los rayos-X han dado lugar a especialidades como la radiología, que permite ver el interior del cuerpo humano para analizar el estado de huesos u órganos. Este tipo de “tecnología” también se suele usar por motivos de seguridad. Por ejemplo, los cuerpos de seguridad especiales tienen equipos de rayos-X para ver a través de determinados materiales, mientras que en otros lugares, como los aeropuertos, se usan para comprobar si los pasajeros llevan algo escondido.

Sin embargo, los rayos-X tienen otras propiedades, menos conocidas pero igualmente increíbles. Son una forma de radiación electromagnética de elevada energía y pequeña longitud de onda; del orden de los espacios existentes entre los átomos de los sólidos. Cuando un haz de rayos-X incide en un material sólido, parte de este haz, como es del mismo tamaño de las distancias interatómicas, puede dar lugar al fenómeno de difracción de rayos-X, que se produce cuando existe una disposición ordenada de átomos.

Por lo general, en las sustancias sólidas, los átomos están ordenados y difractan los rayos-X. Existe una expresión simple que relaciona la longitud de onda de los rayos-X y la distancia interatómica con el ángulo de incidencia del haz difractado: se denomina la ley de Bragg, y es la que determina dónde deben aparecer las señales de difracción si vamos variando el ángulo de incidencia de los rayos-X respecto a la muestra. Esto es lo que se hace en los difractómetros de rayos-X de muestras en polvo, y la señal obtenida es el denominado difractograma.

Un difractograma es como una huella dactilar, es único y característico de una determinada sustancia. Por tanto, si tengo su difractograma puedo conocer qué compuesto (o mezcla de ellos) están presentes en una muestra desconocida, e incluso puedo cuantificar su porcentaje en peso. Estas son las dos aplicaciones fundamentales de la difracción de rayos-X, pero hay muchas más, de entre ellas destacamos las siguientes:

• Ya que el difractograma depende de cómo están ordenados los átomos, teniendo el difractograma de una sustancia podemos llegar a conocer su estructura cristalina, es decir, las posiciones de cada uno de sus átomos. Por poner un ejemplo, esta es la técnica que se usó para conocer la estructura de la doble hélice de ADN.
• La forma de los picos que componen el difractograma, depende del tamaño de los cristalitos existentes en una muestra y de las tensiones existentes entre los átomos que las componen. Estos dos aspectos también se pueden conocer.
• Se puede conocer cómo evolucionan las sustancias con la temperatura, en distintas atmósferas o con humedades relativas distintas y controladas.

Si a todas estas aplicaciones añadimos que la difracción de rayos-X (DRX) es una técnica NO DESTRUCTIVA (la sustancia no se altera durante la medida), tenemos una herramienta analítica muy poderosa. En la unidad de DRX del SCAI de la Universidad de Málaga tenemos 4 difractómetros y estamos esperando otro más. Es una técnica muy demandada, tanto por organismos de investigación, como por particulares o empresas privadas.

Ahora pasamos a contaros algunos de las muestras que se han medido en nuestro laboratorio y que son de interés.

Imanes antical

Una empresa fabricante de imanes antical es usuaria de nuestro servicio y nos piden que comprobemos la eficacia de los imanes que fabrican. Para ello, se estudian los residuos de cal de agua corriente sin tratar y de agua corriente que pasa por tuberías con el imán. En ambos casos se obtiene un polvo blanquecino que se estudia por difracción. Y, ¿qué va a tener ese polvo?, pues cal, claro que cal. Empleamos la DRX para identificar qué minerales están presentes en la muestra de cal. Ambas muestras están compuestas por carbonato de calcio, exactamente con la misma estequiometría y formula química, sin embargo sus difractogramas son distintos, ¿por qué?

La muestra que no ha estado sometida al imán es carbonato cálcico tipo calcita, mientras que la muestra que ha estado sometida al imán es carbonato cálcico tipo aragonito. Mediante DRX hemos sido capaces de diferenciar estos dos compuestos pese a que, químicamente, son exactamente iguales.

En la calcita los átomos se distribuyen de manera que se forman plaquetas que se apilan unas sobre otras y sellan la tubería, sin embargo, en el aragonito la distribución atómica hace que se formen agujitas, que siempre circulan con el torrente de agua y no llegan a taponar.

Es un claro ejemplo de distinta distribución atómica, distinto difractograma y por tanto distintas propiedades, pese a que químicamente sean lo mismo y en multitud de técnicas analíticas sean indiferenciables.

Moneda falsa

Hace algún tiempo un usuario vino al laboratorio para que comprobásemos la autenticidad de una moneda romana. Como la técnica es no destructiva, pudimos medir la moneda tal cual, sin causarle ningún daño y sin que perdiese valor. Medimos dos monedas, una que era de época romana con total seguridad y la moneda dudosa.

Los difractogramas evidenciaban que una de las monedas presentaba reflexiones de cobre (el metal del que estaba hecha), óxido de cobre (por oxidación superficial y patinado) y cuarzo (de la tierra en la que había estado enterrada), sin embargo, la otra moneda presentaba, además, cloruro de cobre y amonio. Este compuesto no es habitual en la corteza terrestre y su procedencia era debida al sistema que se suele utilizar para dotar de un aspecto envejecido a monedas  actuales: las entierran y orinan sobre ellas (urea, amonio).

Imposibilidad de fraguado

Son muchas las empresas cementeras y de materiales de construcción que trabajan con nuestro laboratorio. Casi siempre, cuando nos traen muestras es porque tienen problemas, no suele ser para medidas de rutina. El ejemplo que os pongo es de toneladas de cemento que tuvieron que ser retiradas de una cementera porque no fraguaban. Químicamente estaban bien y cumplían con la norma, pero el cemento no endurecía. La cementera estaba interesada en conocer qué fase o fases mineralógicas eran las responsables de este problema.

Se tomaron varias muestras, se le hizo el difractograma y se observó lo siguiente:

Junto a las fases habituales del cemento se veían reflexiones debidas a óxido de zinc. El ZnO impide el fraguado y no tiene por qué estar presente en el cemento y no fue añadido a conciencia. Investigando de dónde podía proceder, concluimos (junto con nuestro cliente) que provenía de los neumáticos viejos que estaban usando como combustible en el horno de clinkerización.

Las cementeras también acuden a nuestra unidad para conocer la cuantificación mineralógica de las fases que componen un cemento o Clinker, incluido el material amorfo, que es aquel sólido no ordenado.

Arqueometría

Nuestro laboratorio es muy famoso también entre arqueólogos y empresas de arqueología, arqueometría y restauraciones. Recordad que es una técnica no destructiva, por tanto, cualquier muestra por valiosa que sea, puede medirse sin verse alterada.

A continuación os pongo algunos ejemplos curiosos de medidas llevadas a cabo en este campo:

• Hemos medido muchas pastas cerámicas, de diversa procedencia.

Generalmente en estas muestras se han realizado dos tipos de ensayos, el primero de ellos es la identificación mineralógica, de esta manera y por comparación con las muestras estudiadas de origen conocido, se puede llegar a conocer la procedencia de una muestra desconocida y así estudiar las posibles vías comerciales de la época.

Además, se pueden analizar las fases minerales identificadas, observando las presentes y las de neoformación y, conociendo la temperatura a la que esto ocurre, se pueden llegar a conocer las condiciones de cocción en el horno (temperatura y ambiente oxidante o reductor), lo que da una idea al arqueólogo de la manufactura de la época.

• Respecto a las muestras de industrias líticas, se han llevado a cabo medidas para conocer la procedencia de la roca madre de la que fueron pulidas.

En función del contenido en moganita se puede conocer la roca de la que se extrajo el trozo de mineral para hacer el bifaz.

• Respecto a muestras prehistóricas, también llevamos a cabo un estudio muy interesante sobre huesos neandertales, que podrían haber sido sometidos a temperatura. Los huesos eran procedentes de La Cueva del Ángel, en Lucena y el director de la excavación tenía la sospecha de que, por su color grisáceo, habían sido calentados y quería estimar una temperatura aproximada.

Gracias a la ayuda del profesorado de Química Física, se hizo una hoguera en la que se calcinaron huesos de vaca y tejón, y efectivamente, presentaban colores similares. Además, estos huesos se usaron como patrón para hacer el estudio.

Estudiando detalladamente los difractogramas y la forma y anchura de las reflexiones pudimos llegar a estimar el tamaño de partícula. Conforme la temperatura aumenta, el tamaño de partícula también lo hace, siendo esta una manera indirecta de estimar la temperatura a la que los neandertales calentaron estos huesos humanos. ¿con qué propósito los calentaron?......

Peritajes

En la unidad también trabajamos en procesos periciales, sobre todo en lo referente a material de la construcción.

Analizamos muestras de calidad dudosa, por ejemplo, baldosas que supuestamente eran de mármol y concluimos que no lo son. Hormigones que deberían estar hechos con cemento de una determinada calidad y están hechos con otra inferior. Obras de rehabilitación histórica en las que no se puede usar cemento y demostramos que se ha usado, etc…

La difracción de rayos-X abre un extenso mundo por analizar en el que nos sentimos como Sherlock Holmes con una lupa gigante y mucho más “chivata”.

Laura León Reina (Unidad de DRX)